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植物持续不断地遭受病原菌的入侵,但只有极少数病原菌能够成功侵染植物并导致病害的发生。这表明,植物具有极其精细的调控机制来识别病原菌并快速激发其防卫反应来抵御病原菌的入侵。事实上,植物虽并不像动物那样具有免疫细胞,但在长期和病原菌的斗争中,植物进化出了一套极其复杂精细的监控体系,来特异识别进入宿主细胞的异物。位于植物细胞膜上的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)能够特异地识别位于病原菌表面的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激活植物先天免疫PTI(PAMP-triggered immunity)。 PTI是植物与病原菌长期互作的过程中形成的第一道防御系统。PTI反应表现为活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)爆发、MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase)信号级联的激活、防卫相关基因的表达及胼坻质沉积等。多个革兰氏阴性病原细菌通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白进入宿主细胞,靶向位于植物细胞膜的PRRs或下游的信号组分来抑制植物PTI反应,导致植物发生ETS (Effector-triggered susceptibility)。然而截至目前,大多数效应蛋白的生化功能及其抑制PTI的分子机理并不清楚。因此,研究这些效应蛋白在寄主体内的靶蛋白及其作用机制,将有助于加深我们对细菌致病机理和植物免疫应答的理解。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。借助Ⅲ型分泌系统,Xcc可将多个效应蛋白转运至寄主细胞,抑制寄主的防卫反应,达到在寄主体内繁殖的目的。目前,多数Xcc效应蛋白作用机理的研究还不是很清楚。我们实验室前期发现了一个编码48kD的效应蛋白XoPDXcc8004,XopDXcc8004N端有三个EAR (ethylene-responsive element binding factor associated amphiphilic repression) motif, C端为SUMO蛋白酶。利用Xcc和拟南芥互作系统,我们研究发现,XOPDXcc8004能够抑制flg22诱导的FRK1基因表达、活性氧爆发及胼坻质沉积。注射接种发现,XOPDXcc8004在植物叶肉细胞中发挥无毒蛋白的功能,能够抑制植物先天免疫PTI却激活SA和JA信号通路,并抑制Xcc8004在拟南芥叶肉细胞的生长。我们以XopDxcc8004为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,筛选出拟南芥NAC转录因子ATAF2与XopDXcc8004互作。我们发现XOPDXcc8004能够阻断ATAF2的26S蛋白酶体降解,稳定ATAF2借助ataf2突变体,我们证实了XOPDXcc8004抑制植物先天免疫PTI及激活SA和JA信号通路依赖ATAF2。 ATAF2是NAC家族的一员,在原生质体中ATAF2抑制FRK1基因的表达,并探索了ATAF2在PTI信号通路的作用位点。本研究发现ATAF2能够体外与MPK3和MPK6互作,且ATAF2抑制FRK1基因表达的功能依赖于MPK3。我们还发现ATAF2能够被磷酸化且磷酸化位点依赖ATAF2第67位丝氨酸,突变其磷酸化位点后ATAF2丧失了抑制FRK1基因表达的能力。我们构建酵母诱饵载体pGBKT7-ATAF2,转化酵母菌株Y2HGold后,利用拟南芥cDNA文库筛选ATAF2互作蛋白,结果发现拟南芥RING结构域E3泛素连接酶RHA2a多次重复出现。我们在酵母中验证了ATAF2和RHA2a的互作,体外GST-pull down和体内CO-IP实验进一步证实ATAF2与RHA2a互作,并发现ATAF2蛋白水平与RHA2a密切相关。随后,本研究揭示了RHA2a是植物先天免疫PTI的重要负调因子——-RHA2a能够负调flg22诱导的ROS、胼坻质沉积、拟南芥根生长抑制和幼苗生长抑制并促进Pst DC3000的生长。 ...